Pengertian, Prinsip dan Faktor Penentu Keberhasilan Pewarnaan Gram Pada Bakteri

Pengertian, Prinsip dan Faktor Penentu Keberhasilan Pewarnaan Gram Pada Bakteri

A.     Bakteri

Bakteri merupakan mikroorganisme bersel tunggal dengan komponen selular prokariotik atau tidak memiliki inti sel.

B.     Pewarnaan

Pada umumnya sel  bakteri  tidak berwarna. Apabila dilarutkan  di  dalam  air, kemudian dilihat  di  bawah mikroskop akan sulit terlihat. Warna sel bakteri dapat dibuat lebih kontras agar lebih mudah dilihat di bawah mikroskop dengan cara mewarnai sel tersebut dengan zat warna tertentu. Beberapa zat yang digunakan untuk mewarnai bakteri dapat juga digunakan untuk mengamati struktur sel bagian dalam.

Dalam pewarnaan bakteri, dapat digunakan satu jenis zat warna sehingga disebut dengan pewarnaan sederhana. Beberapa zat-zat warna yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana adalah fuchin basa, biru metilen, atau violet kristal. Zat-zat warna tersebut digunakan karena mengandung gugusan fungsional yang dapat membentuk warna (khromofor) dan bermuatan positif. Sehingga sel-sel bakteri pada umumnya   bermuatan   negatif, dapat   mengikat warna Zat-zat warna demikian disebut zat warna basa. Zat warna yang mengandung khromofor yang bermuatan negatif/ anion, disebut zat warna asam, sehingga tidak dapat digunakan untuk mewarnai bakteri.

Beberapa cara perwarnaan yang dilakukan untuk mewarnai bakteri merupakan modifikasi atau gabungan dari cara pewarnaan sederhana. Beberapa jenis pewarnaan bakteri adalah sebagai berikut:

1.         Pewarnaan sederhana

2.         Pewarnaan diferensial

3.         Pewarnaan structural

4.         Pewarnaan  uji

Dalam halaman ini akan dibahas pewarnaan sederhana. Untuk pewarnaan diferensial, structuran dan uji cek di pencarian web ini yaa.

C.     Pewarnaan Gram

Berdasarkan respon terhadap pewarnaan gram, bakteri dibedakan menjadi dua jenis yaknibakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan dari kedua jenis bakteri tersebut terletak pada struktur dinding selnya. Dinding sel bakteri gram positif terdiri dari lapisan peptidoglikan homogen dengan ketebalan sekitar 20–80 nm yang terletak di luar lapisan membrane plasma. Sedangkan dinding sel bakteri gram negatif ketebalan lapisan peptidoglikannya lenih tipis, yaitu antara 2–7 nm dan dilapisi oleh membran luar dengan ketebalan 7–8 nm. Sehingga peptidoglikan yang lebih tebal dari bakteri gram positif tersebut menjadikan  bakteri ini akan terlihat  berwarna ungu dibandingkan dengan  bakteri gram negatif yang akan menghasilkan warna pink/ merah jika dilakukan pewarnaan. Berikut  adalah gambarnya:

Gambar Perbedaan Bakteri. a) Gram positif. b) Gram Negatif

Metode pewarnaan gram pada bakter ini menggunakan beberapa larutan yaitu kristal  violet, iodin,  alkohol dan  safranin.  Prinsipnya ketika sediaan dilarutkan dengan kristal violet, warna ungu dari larutan kristal violet ini akan ditahan oleh struktur peptidoglikan  bakteri, kemudian ditambah dengan iodin yang juga berfungsi sebagai penahan, sehingga di awal sediaan akan berwarna ungu. Kemudian sediaan disirami  alkohol  yang   bisa   menghapus  zat   warna  ungu dari kristal violet tadi. Pori-pori peptidoglikan yang kecil ditambah dengan adanya  iodin  maka  zat  warna  ungu  tersebut akan sulit  untuk  terhapus  oleh  alkohol sehingga  akan tetap terlihat  berwarna ungu untuk bakteri gram positif.  Sedangkan untuk bakteri gram negatif, karena  struktur pori-pori peptidoglikan dari bakteri gram negatif yang lebih besar (dinding sel lebih tipis), maka alkohol akan lebih mudah untuk menetralisir atau menghapus zat warna ungu yang ada pada peptidoglikan, sehingga bakteri akan terlihat berwarna pink/ merah setelah pemberian safranin. Untuk lebih mudahnya, begini alurnya:

1.      Bakteri gram positif

Sediaan sampel bakteri (dilarutkan kristal violet ditambah iodin) à Sediaan berwarna ungu (disiram alkohol lalu safranin) à ungu

2.      Bakteri gram negatif

Sediaan sampel bakteri (dilarutkan kristal violet ditambah iodin) à Sediaan berwarna ungu (disiram alkohol lalu safranin) à merah/ pink.

      Perhatikan gambar dibawa ini yaa:

D.     Persiapan Sediaan

Sebelum melakukan pewarnaan, langkah awal yang harus dilakukan adalah fiksasi. Fiksasi adalah proses membunuh bakteri kemudian membuat sel bakteri tersebut melekat pada kaca preparat, biasanya digunakan panas dari pembakar spirtus. Sebelum dilakukan pewarnaan, sel-sel bakteri harus difiksasi pada kaca preparat terlebih dahulu. Jika tidak, maka lapisan sel yang akan diwarnai tidak menempel dan akan tercuci selama proses pewarnaan.

Langkah pertama menyebarkan sediaan (kultur bakteri) pada kaca preparat sehingga terbentuk lapisan sel yang tipis. Lapisan tersebut kemudian diangin-anginkan di udara terbuka baru kemudian dilakukan fiksasi secara singkat di atas nyala api. Jika berasal dari media cair maka penyebaran dapat langsung dilakukan di atas kaca preparat yang bersih menggunakan loop. Namun, jika kultur diambil dari agar padat maka langkah sebelumnya di atas kaca preparat harus diberi setetes air, kemudian diambil satu koloni bakteri dengan ujung loop yang telah dipijarkan, dan selanjutnya diratakan di atas kaca preparat sampai terbentuk lapisan tipis.

E.   Faktor Penentu Keberhasilan Pewarnaan

Dalam pewarnaan bakteri, terdapat beberapa faktor penentu keberhasil. Jika salah satu faktor tersebut diabaikan, bukan hal yang mustahil jika terjadi kesalahan hasil analisis. Berikut beberapa faktor-faktor penentu keberhasilan pewarnaan gram:

1.      Kaca preparat bersih dan bebas lemak

2.      Umur biakan (optimal) kira-kira  18-24 jam kecuali bakteri tahan asam  (M tuberculosis).

3.      Pelaksanaan fiksasi panas pada sediaan

4.      Kerapatan sel pada sediaan/ tebal tipisnya sediaan

5.      Kualitas zat warna baik dan tidak kadaluarsa

6.      Konsentrasi dan umur-umur reagen yang digunakan untuk pewarnaan gram.

7.      Sifat, konsentrasi dan jumlah pemucat yang digunakan.

8.      Sejarah biakan.

      Kesalahan  yang  sering  dilakukan  adalah  pengambilan  koloni yang terlalu banyak dari media agar padat (faktor No.4), sehingga lapisan sel pada kaca preparat terlalu tebal. Keadaan ini mempengaruhi hasil pewarnaan menjadi kurang baik, terutama jika pada tahap pencucian zat warna (destaining/ decolorizing) karena sel-sel bakteri bertumpuk menyebabkan sebagian zat warna akan sulit dicuci, dan tetap   tertinggal   sehingga dapat menghasilkan analisis pengamatan yang salah.

Sampai disini dulu yaa. Cek di postingan lainnya sesuai yang kamu butuhkan. Tetap dirumah yaa nak.. Jangan lupa absen dikolom komentar yaa: Nama(spasi)Kelas/Komli(spasi)No.abs(spasi)TanggapanKalian. 

waasalamu'alaikum.  :)